کیت Real-Time Pcr شرکت Invitrogen
در دنیای تحقیقات زیستشناسی مولکولی امروز، دقت، سرعت و تکرارپذیری نتایج از مهمترین ارکان یک مطالعه موفق به شمار میروند. تکنیک Real-Time PCR یا واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی، به عنوان یک استاندارد طلایی برای کمّیسازی اسیدهای نوکلئیک شناخته میشود. در این میان، شرکت Invitrogen که یکی از برندهای پیشرو و زیرمجموعه شرکت Thermo Fisher Scientific است، با ارائه طیف وسیعی از کیتهای تخصصی، انقلابی در این حوزه ایجاد کرده است. این شرکت آمریکایی که در سال ۱۹۸۷ تأسیس شد، با بیش از سه دهه تجربه در تولید محصولات نوآورانه برای ژنومیکس، پروتئومیکس و زیستشناسی سلولی، به یکی از معتبرترین نامها در تأمین تجهیزات و کیتهای تحقیقاتی در سراسر جهان تبدیل شده است. در این مقاله، به بررسی عمیق و فوقتخصصی ماهیت، فناوری تولید و کاربردهای کیتهای Real-Time PCR این شرکت میپردازیم.
ماهیت کیتهای Real-Time PCR شرکت Invitrogen فراتر از یک مجموعه ساده از معرفها است. این کیتها در حقیقت سیستمهای کاملاً بهینهسازی شدهای هستند که برای رفع چالشهای خاص محققان در آنالیز بیان ژن طراحی شدهاند. هسته اصلی این فناوری بر پایه حذف زمانبرترین و پرخطاترین مرحله در فرآیند کلاسیک Real-Time PCR یعنی استخراج و خالصسازی RNA بنا نهاده شده است. به عنوان مثال، در کیتهای انقلابی Cells-to-CT™، محقق قادر است مستقیماً از سلولهای کشت داده شده، بدون نیاز به استخراج RNA، به مرحله انجام واکنش وارد شود. ماهیت این کیتها در ترکیب هوشمندانه یک بافر لیزکننده پیشرفته با آنزیمهای با کارایی بالا خلاصه میشود. بافر لیزکننده با نفوذ به غشای سلولی، محتویات سلول از جمله RNA را در مدت زمانی کمتر از پنج دقیقه آزاد میکند و همزمان با غیرفعال کردن آنزیمهای RNAse، از تخریب نمونه جلوگیری مینماید. این فناوری که با نام Lysis Enhancer شناخته میشود، قلب تپنده این کیتها است و امکان پردازش نمونهها را در دمای اتاق فراهم میآورد.
فرآیند تولید این کیتها توسط Invitrogen نمونهای از دقت در مهندسی پروتئین و شیمی ترکیبات است. آنزیم کلیدی به کار رفته در این کیتها، یعنی Reverse Transcriptase از نوع SuperScript™ III یا ThermoScript™، با استفاده از فناوری DNA نوترکیب در میزبانهای باکتریایی مهندسی شده تولید میشود. این آنزیمها به گونهای طراحی شدهاند که پایداری حرارتی بالایی داشته و توانایی سنتز cDNA از RNA های با ساختار ثانویه پیچیده را حتی در دماهای بالا دارند. در کنار آن، پلیمراز اختصاصی Platinum™ Taq DNA Polymerase با یک رویکرد مهندسی شده منحصر به فرد همراه است. این آنزیم به همراه یک آنتیبادی طراحی شده علیه آن تولید میشود که در دماهای پایین به پلیمراز متصل شده و فعالیت آن را مهار میکند. در مرحله Hot-Start سیکل حرارتی، با افزایش دما، آنتیبادی غیرفعال شده و پلیمراز آزاد میشود. این مکانیزم از تشکیل پرایمر-دایمر و محصولات غیراختصاصی در دماهای پایین جلوگیری کرده و حساسیت و ویژگی آزمون را به شدت افزایش میدهد. تمامی این اجزا شامل بافرهای واکنش با غلظت دوبرابر 2X Reaction Mix که حاوی dNTPs، MgCl2 و گاهی مواد مرجع ROX است، در شرایط کاملاً استریل و عاری از نوکلئاز بستهبندی شده و به صورت لیوفیلیزه یا مایع در دمای منفی بیست درجه برای حفظ پایداری طولانیمدت عرضه میشوند.
اهمیت این کیتها در دنیای تحقیقات مدرن، فراتر از صرفاً سادهسازی فرآیند آزمایشگاهی است. مهمترین مزیت این محصولات، افزایش چشمگیر دقت و تکرارپذیری نتایج در مطالعات ژنتیکی است. روشهای سنتی استخراج RNA، به دلیل مراحل متعدد پاساژ و انتقال نمونه، همواره با خطر افت نمونه یا تخریب آن مواجه هستند. این مسئله به ویژه در هنگام کار با نمونههای کمیاب یا با تعداد سلول محدود مانند نمونههای حاصل از میکروتشریح لیزری یا سلولهای بنیادی، میتواند منجر به نتایج غیرواقعی شود. کیتهای Invitrogen با حذف این مراحل، نه تنها زمان مورد نیاز برای آنالیز یک پلیت نود و شش خانهای را از چند ساعت به حدود هفتاد دقیقه کاهش میدهند، بلکه با کاهش خطای انسانی و حفظ یکپارچگی RNA، دادههایی با ارزش آماری بالاتر تولید میکنند. از منظر زیستمحیطی نیز، این فناوری گام بزرگی به جلو محسوب میشود، چراکه با حذف ستونهای خالصسازی و لولههای متعدد، میزان پسماند پلاستیکی تولید شده در آزمایشگاه را تا بیش از نود درصد کاهش میدهد.
کاربردهای این کیتها طیف گستردهای از مطالعات زیستشناسی سلولی و مولکولی را پوشش میدهد. یکی از برجستهترین کاربردها، در مطالعات اعتبارسنجی ناکداون ژنی با استفاده از فناوری RNA interference است. محققان میتوانند سلولهای تیمار شده با siRNA را مستقیماً در همان پلیت کشت لیز کرده و با استفاده از کیتهای یک مرحلهای یا دو مرحلهای Invitrogen، میزان کاهش بیان ژن هدف را در زمان واقعی اندازهگیری کنند. این قابلیت، امکان غربالگری با توان عملیاتی بالا را برای یافتن مؤثرترین توالیهای siRNA یا ترکیبات دارویی فراهم میکند. همچنین در حوزه تحقیقات سرطان، این کیتها برای مطالعه بیان ژنها در سلولهای تومورال جدا شده از بافت یا حتی در سلولهای منفرد سرطانی که با روش فلوسایتومتری جداسازی شدهاند، به کار گرفته میشوند. توانایی شناسایی اهداف از صد هزار سلول تا حتی یک سلول منفرد Single Cell-to-CT™، افقهای جدیدی را در مطالعه هتروژنیته تومور و زیستشناسی سلولهای بنیادی سرطانی گشوده است.
کاربرد تخصصی دیگر این کیتها در حوزه ویروسشناسی و تشخیص عوامل بیماریزا است. کیتهای یک مرحلهای One-Step qRT-PCR Invitrogen که ترکیبی از رونویسی معکوس و تکثیر PCR در یک لوله هستند، ابزاری ایدهآل برای ردیابی سریع و حساس RNA ویروسها از جمله آنفلوآنزا یا کروناویروسها در نمونههای بالینی به شمار میروند. این سیستمها با استفاده از پروبهای هیدرولیز TaqMan یا رنگهای متصل شونده به DNA مانند SYBR Green، امکان مانیتورینگ پیوسته تجمع محصول را فراهم میکنند. همچنین وجود رنگ مرجع ROX در فرمولاسیون برخی از این کیتها، نرمالسازی سیگنال بین چاهکهای مختلف را در دستگاههای Real-Time PCR گوناگون امکانپذیر ساخته و دقت آنالیزهای کمی را افزایش میدهد. در مجموع، کیتهای Invitrogen با ترکیب فناوریهای پیشرفته آنزیمی و شیمیایی، استانداردهای جدیدی را در زمینه سرعت، صحت و سهولت آنالیز بیان ژن تعریف کرده و به عنوان یک ابزار حیاتی در پیشبرد مرزهای دانش ژنتیک و پزشکی مولکولی ایفای نقش میکنند.
بدون دیدگاه