کروماتوگرافی
کروماتوگرافی به عنوان یکی از پرکاربردترین تکنیکهای جداسازی در علوم شیمی، بیوشیمی، داروسازی و علوم زیستی، مبتنی بر توزیع متفاوت اجزای یک مخلوط بین دو فاز است: فاز ساکن با ساختاری مشخص و فاز متحرک که از روی یا داخل فاز ساکن عبور میکند. اساس جداسازی، اختلاف در ضریب توزیع یا عوامل برهمکنش مولکولی (مانند برهمکنشهای هیدروفوبیک، یونی، قطبیتی، اندازهای و اختصاصی) بین تحلیلنیاها با این دو فاز است. این تکنیک قادر به جداسازی، شناسایی و اندازهگیری کمی ترکیبات از گازها تا مولکولهای زیستی پیچیده با حساسیت و انتخابپذیری بالا میباشد.
طبقهبندی روشهای کروماتوگرافی بر اساس معیارهای مختلف:
- بر اساس ماهیت فاز متحرک و ساکن:
- کروماتوگرافی گازی : (GC) فاز متحرک یک گاز بیاثر (حامل) و فاز ساکن میتواند یک جامد جاذب (GSC) یا یک مایع پوششدهنده روی یک جامد بیاثر (GLC) باشد. مناسب برای ترکیبات فرار و پایدار حرارتی.
- کروماتوگرافی مایع : (LC) فاز متحرک یک مایع است. فاز ساکن میتواند جامد (کروماتوگرافی جذب سطحی، کروماتوگرافی تبادل یونی) یا یک فاز مایع پیوند خورده روی جامد باشد. زیرمجموعه اصلی و پیشرفته آن کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) است.
- کروماتوگرافی مایع-گازی : (SFC) فاز متحرک یک سیال فوق بحرانی معمولاً CO₂ است که ویسکوزیته پایین و نفوذپذیری بالایی دارد.
- بر اساس مکانیسم جداسازی:
- کروماتوگرافی تقسیمی : جداسازی بر اساس اختلاف در حلالیت تحلیلنیاها بین فاز متحرک و فاز ساکن مایع صورت میگیرد، مانند HPLC با فاز معکوس.
- کروماتوگرافی جذب سطحی : جداسازی بر اساس جذب فیزیکی متفاوت مولکولها بر سطح فعال یک جامد (مانند سیلیکاژل) انجام میشود.
- کروماتوگرافی بر پایه اندازه : جداسازی بر اساس اندازه هیدرودینامیکی مولکولها و با استفاده از ستونهای پر شده از ذرات متخلخل انجام میشود. مولکولهای بزرگتر سریعتر خارج میشوند.
- کروماتوگرافی تبادل یونی : جداسازی بر اساس بار خالص مولکولها و با استفاده از فاز ساکنی با گروههای عاملی دارای بار مخالف انجام میگیرد.
- کروماتوگرافی آفینیتی : انتخابیترین روش، مبتنی بر برهمکنش بیوشیمیایی اختصاصی (مانند آنتیژن-آنتیباد، آنزیم-سوبسترا) بین تحلیلنیا و لیگاندی است که روی فاز ساکن تثبیت شده است.
- بر اساس شکل فاز ساکن:
- کروماتوگرافی ستونی : فاز ساکن در داخل یک ستون بستهبندی شده است شامل GC، HPLC، کروماتوگرافی ستونی کلاسیک.
- کروماتوگرافی صفحهای یا لایه نازک : فاز ساکن بر روی یک صفحه مسطح (شیشه، پلاستیک، آلومینیوم) پوشانده شده و فاز متحرک بر اساس عمل موئینگی حرکت میکند.
- کروماتوگرافی کاغذی : در این روش ساده، فاز ساکن لایهای از سلولز موجود در کاغذ است.
توضیح تخصصی روشهای اصلی کروماتوگرافی :
- کروماتوگرافی گازی: (GC)
در این روش نمونه تبخیر شده و توسط گاز حامل (معمولاً هلیوم، نیتروژن، هیدروژن) از داخل ستون عبور داده میشود. ستونها دو نوع اصلی هستند: ستونهای بستهبندی شده و ستونهای مویین با قطر داخلی بسیار کم و پوششدهی شده با فاز ساکن. تشخیص پس از خروج از ستون توسط آشکارسازهایی مانند FID برای ترکیبات آلی کربندار، TCD برای تمامی گازها، MS (برای شناسایی ساختاری) و ECD (برای ترکیبات هالوژنه) انجام میپذیرد. از GC برای آنالیز ترکیبات فرار در عطرها، سوختها، داروها، محیط زیست و … استفاده میشود.
- کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا: (HPLC)
پیشرفتهترین و پرکاربردترین شکل کروماتوگرافی مایع، که در آن فاز متحرک مایع تحت فشار بالا (تا چند صد بار) از داخل ستونی با ذرات ریز (معمولاً ۳-۵ میکرومتر) عبور میکند. این امر سرعت و رزولوشن جداسازی را به طور چشمگیری افزایش میدهد. سیستمهای HPLC معمولاً شامل مخزن حلال، پمپ فشار بالا، انژکتور، ستون، آشکارساز و سیستم ثبت داده است. بر اساس ماهیت فاز ساکن، دو حالت اصلی وجود دارد:
- HPLC فاز نرمال: فاز ساکن قطبی (مانند سیلیکاژل) و فاز متحرک غیرقطبی است.
- HPLC فاز معکوس: پرکاربردترین حالت، که در آن فاز ساکن غیرقطبی (مانند زنجیرههای هیدروکربنی C18 یا C8 پیوند خورده به سیلیکا) و فاز متحرک قطبی (مخلوط آب و حلالهای آلی مانند متانول یا استونیتریل) است. جداسازی بر اساس میزان آبگریزی مولکولها صورت میگیرد.
- آشکارسازهای رایج شامل UV-Vis، آرایهای دیود (DAD)، فلورسانس، اشعهتابی (RI) و طیفسنج جرمی (LC-MS) میباشند. کاربردهای آن در کنترل کیفی داروها، آنالیز مواد غذایی، مطالعات فارماکوکینتیک، پروتئومیکس و … حیاتی است
- کروماتوگرافی لایه نازک:
یک روش ساده، سریع و کمهزینه برای سنجش کیفی، خلوص و همچنین جداسازی مقادیر کم ماده. در این روش، صفحه پوشیده از جاذب (معمولاً سیلیکاژل) به عنوان فاز ساکن عمل میکند. نمونه در پایین صفحه قرار گرفته و صفحه درون حاوی حلال (فاز متحرک) قرار میگیرد. حلال از طریق خاصیت موئینگی بالا رفته و اجزا را بر اساس میزان میل به فاز متحرک و ساکن جدا میکند. محل هر جزء با محاسبه فاکتور بازداری مشخص میشود.
- کروماتوگرافی اندازهگیری مولکولی (SEC) و تبادل یونی (IEC):
- SEC: در بیوشیمی برای تعیین وزن مولکولی پروتئینها، پلیساکاریدها و پلیمرها استفاده میشود. در حالت استفاده از فاز آبی به آن کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون (GFC) و در فاز آلی کروماتوگرافی نفوذی ژل (GPC) گفته میشود.
- IEC: برای جداسازی مولکولهای باردار مانند اسیدهای آمینه، پپتیدها، پروتئینها، نوکلئیک اسیدها و یونهای معدنی کاربرد دارد. فازهای ساکن دارای گروههای عاملی کاتیونی (مانند سولفونات) یا آنیونی (مانند آمونیوم چهارتایی) هستند.
- کروماتوگرافی آفینیتی:
یک روش بسیار اختصاصی برای جداسازی و تخلیص بیومولکولها. ستون با یک لیگاند اختصاصی (مانند آنتیباد، کوفاکتور، مهارکننده) پوشش داده میشود. تنها مولکول هدف که با این لیگاند برهمکنش قوی دارد، به دام افتاده و بقیه عبور میکنند. سپس با تغییر شرایط (مانند pH یا غلظت نمک مولکول هدف شسته و جمعآوری میشود. کروماتوگرافی آفینیتی فلزی برای تخلیص پروتئینهای دارای برچسب هیستیدین معروف است.
برندهای تجهیزات و مواد کروماتوگرافی
بازار ایران میزبان طیفی از برندهای بینالمللی و نیز محصولات تولید داخلی در حوزه کروماتوگرافی است که عمدتاً از طریق شرکتهای نمایندگی و تأمینکننده علمی به فروش میرسند. این محصولات شامل دستگاههای کامل، ستونها، فازهای ساکن، حلالهای درجه کروماتوگرافی و لوازم مصرفی میباشند.
برندهای بینالمللی مطرح کروماتوگرافی :
-
- آمریکا و اروپا: برندهایی مانند Agilent Technologies و Waters Corporation از پیشگامان و دارای سهم بازار بالا در دستگاههای GC، GC-MS، HPLC و LC-MS هستند. برند Thermo Fisher Scientific شامل خطوط محصولات قدیمی Fisher و Dionex نیز در دستگاههای HPLC، IC و طیفسنج جرمی حضور قدرتمندی دارد Shimadzu . (ژاپن) و PerkinElmer (آمریکا) از دیگر برندهای پرطرفدار با پشتیبانی نسبتاً گسترده در ایران میباشند. برند Bruker (آلمان/آمریکا) نیز در حوزه GC-MS و LC-MS فعال است. در زمینه ستونهای کروماتوگرافی، برندهای Phenomenex، Agilent، Waters، Thermo Scientific وSupelco اکنون بخشی از Merck بسیار معتبر هستند.
- چین: در سالهای اخیر برندهای چینی با ارائه محصولات با قیمت رقابتیتر، حضور پررنگتری یافتهاند. از جمله این برندها میتوان به Fuli در زمینه GC و HPLC، EWAI، Puxin و LabTech اشاره کرد.
در انتخاب برند و تأمینکننده در ایران، عواملی مانند پشتیبانی فنی و خدمات پس از فروش، در دسترس بودن قطعات یدکی و مواد مصرفی اختصاصی (مانند ستونها)، وجود نیروی متخصص برای تعمیر و نگهداری و همچنین تحریمها و محدودیتهای مالی نقش بسیار تعیینکنندهای دارند.
بدون دیدگاه