کیت استخراج پلاسمید
در قلب پژوهشهای نوین زیستشناسی مولکولی، مهندسی ژنتیک و زیستفناوری، پلاسمیدها به عنوان حاملهای کلونی و بیان ژن نقشی محوری ایفا میکنند. پلاسمیدها مولکولهای DNA دو رشتهای حلقوی کوچک و مستقل از کروموزوم باکتری هستند که قابلیت تکثیر خودکار را دارا میباشند. استخراج سریع، با خلوص بالا و با بازدهی مناسب این پلاسمیدها از کشت باکتری، گامی اساسی و مکرر در اکثر پروتکلهای آزمایشگاهی از کلونینگ ژن تا تولید پروتئینهای نوترکیب محسوب میشود. کیتهای استخراج پلاسمید با ارائه پروتکلهای استاندارد، سریع و قابل اطمینان، این فرآیند را به شدت سادهسازی و بهینهسازی کردهاند. شرکت آزماکالا، با تمرکز بر تأمین پیشرفتهترین و باکیفیت ترین مواد آزمایشگاهی، مجموعهای جامع از کیتهای استخراج پلاسمید را از برندهای معتبر جهانی همچون Genall ،Thermo Fisher ، Takara، New England و…. عرضه میدهد، تا پژوهشگران با اطمینان خاطر بتوانند بر اهداف علمی اصلی خود متمرکز شوند.
اصول بنیادی و مکانیسمهای استخراج پلاسمید:
اساس کار اکثر کیتهای استخراج پلاسمید مدرن بر پایه روش برمید سدیم-قلیایی استوار است که با اصلاحاتی برای افزایش خلوص و کارایی همراه شده است. این فرآیند چند مرحلهای کلیدی را شامل میشود. ابتدا سلولهای باکتری حاوی پلاسمید مورد نظر، معمولاً سویههای اشریشیا کلی مانند DH5α یا TOP10، از فاز رشد لگاریتمی یا stationary harvest شده و پس از سانتریفیوژ، pellet سلولی تهیه میگردد. مرحله لیز قلیایی قلب این فرآیند است. در این مرحله، pellet سلولی در یک محلول حاوی سدیم دودسیل سولفات و سدیم هیدروکسید رزوسپند میشود. SDS که یک دترجنت آنیونی قوی است، غشای سلولی و دیواره باکتری را تخریب میکند. سدیم هیدروکسید با ایجاد شرایط قلیایی شدید باعث دناتوره شدن DNA دو رشتهای میشود. در این شرایط، DNA کروموزومی حلقوی بزرگ با شکسته شدن به قطعات خطی، به طور برگشتناپذیری دناتوره میشود. در مقابل، مولکولهای پلاسمید کوچک و سوپرکویل، اگرچه دناتوره میشوند، اما به دلیل ساختار فشرده و حلقوی، رشتههای مکمل خود را در مجاورت نگه میدارند. افزودن مرحلهای حیاتی به نام خنثیسازی با استفاده از یک بافر استات پتاسیم با pH اسیدی، باعث بازگشت سریع pH به حالت خنثی میشود. در این بازگشت ناگهانی، رشتههای مکمل DNA پلاسمید که از هم جدا نشده بودند، به سرعت و به صورت صحیح بازپیچیده میشوند و مولکولهای دو رشتهای حلقوی و فعال را بازمییابند. در مقابل، DNA کروموزومی خطی دناتوره شده، به طور نامناسب بازپیچیده شده و به همراه پروتئینهای سلولی دناتوره و SDS که در این pH کمپلکسهای نامحلول تشکیل میدهد، یک لایه ژلهای و رسوبی را تشکیل میدهند. جداسازی این رسوب از طریق سانتریفیوژ، فاز مایع حاوی پلاسمید خالص را آزاد میکند.
مرحله تصفیه و تخلیص نهایی کیت استخراج پلاسمید
محلول حاصل از مرحله قبل، اگرچه عاری از DNA کروموزومی و پروتئینهای عمده است، اما هنوز حاوی نمکها، متابولیتهای سلولی، RNA و سایر ناخالصیها میباشد. کیتهای مدرن از ستونهای کروماتوگرافی اتصال سیلیکایی برای تخلیص اختصاصی پلاسمید استفاده میکنند. اساس این روش، خاصیت جذب DNA به ماتریکس سیلیکا در حضور نمکهای chaotropic با غلظت بالا مانند گوانیدینیوم تیوسیانات یا کلرید است. این نمکها با ایجاد اختلال در شبکه آبپوشانی مولکولها، باعث میشوند DNA به صورت انتخابی به سطح سیلیکا متصل شود، در حالی که اکثر ناخالصیها شسته و عبور میکنند. محلول حاوی پلاسمید پس از مرحله خنثیسازی، با یک بافر chaotropic مخلوط شده و بر روی ستون سیلیکایی بارگذاری میشود. پس از اتصال پلاسمید به ستون، یک یا چند مرحله شستشو با بافرهای حاوی اتانول انجام میشود تا نمکهای باقیمانده و سایر آلایندهها به طور کامل حذف شوند. در نهایت، DNA پلاسمید خالص با استفاده از یک بافر شویش با قدرت یونی پایین، معمولاً آب عاری از نوکلئاز یا بافر TE، از ستون جدا میشود. این بافر با رقابت برای جایگزینی با DNA در محل اتصال، آن را از ستون آزاد میکند. محصول نهایی، محلولی شفاف حاوی پلاسمید با خلوص بسیار بالا است که مستقیماً برای کاربردهای بعدی مانند توالییابی، آنزیمهای محدودکننده، ترانسفکشن سلولی یا کلونینگ قابل استفاده است.
انواع کیتهای استخراج پلاسمید و معیارهای انتخاب
کیتهای استخراج پلاسمید در مقیاسهای متفاوتی از مینیپرپ برای غربالگری کلونیها و استخراج از حجم کم کشت تا مگا یا میدی پرپ برای تهیه مقادیر میلیگرمی پلاسمید از لیترها کشت باکتری طراحی شدهاند. انتخاب مقیاس مناسب به حجم کاربرد نهایی بستگی دارد. همچنین کیتهایی با پروتکلهای فوقسریع وجود دارند که کل فرآیند را در کمتر از ۱۵ دقیقه و گاهی بدون نیاز به سانتریفیوژ و تنها با استفاده از خلأ انجام میدهند. یک پارامتر کلیدی در انتخاب کیت، کیفیت و خلوص نهایی پلاسمید است. خلوص بالا به معنای عاری بودن از نمکهای chaotropic، RNA، اندوتوکسینها و پروتئینها است. حضور اندوتوکسین میتواند در کاربردهای حساسی مانند ترانسفکشن سلولهای اولیه یا تولید ویروس برای ژن درمانی بسیار مضر باشد. برخی کیتهای تخصصی، ستونهایی با قدرت اتصال بسیار بالا برای پلاسمیدهای با اندازه بسیار بزرگ یا کاسمیدها و فاژمیدها ارائه میدهند. همچنین کیتهای اتوماتیک یا نیمهاتوماتیک وجود دارند که با استفاده از دستگاههای خاص، امکان پردازش همزمان تعداد زیادی نمونه را فراهم میکنند و برای آزمایشگاههای با توان نمونهبرداری بالا ایدهآل هستند.
کاربردهای پلاسمید استخراج شده
پلاسمیدهای استخراج شده با خلوص بالا سوخت موتور بسیاری از فناوریهای زیستی هستند. در کلونینگ مولکولی، این پلاسمیدها به عنوان وکتور برای وارد کردن ژنهای مورد نظر استفاده میشوند. در بیان پروتئینهای نوترکیب در سیستمهای باکتریایی، مخمری، حشرهای یا پستانداران، پلاسمیدهای بیانکننده، حامل دستورالعمل تولید پروتئین هدف هستند. کیفیت پلاسمید مستقیماً بر بازده تولید تأثیر میگذارد. در ترانسفکشن سلولهای یوکاریوتی، خلوص پلاسمید برای به حداکثر رساندن بازده ورود DNA به سلول و کاهش سمیت سلولی حیاتی است. آلودگی به اندوتوکسین میتواند پاسخ ایمنی سلول را فعال کرده و بیان ژن را مختل کند. در تولید ویروسهای نوترکیب برای واکسنسازی یا ژن درمانی، پلاسمیدهای با کیفیت بالا برای تولید ذرات ویروسی سالم و با تیتر مناسب ضروری است. همچنین در تکنیکهایی مانند توالییابی نسل جدید، پلاسمیدهای خالص به عنوان کنترل مثبت یا برای ساخت کتابخانههای ژنومی استفاده میشوند
خدمات تخصصی شرکت آزماکالا
شرکت آزماکالا با درک عمیق از نیازهای متنوع جامعه پژوهشی کشور، اقدام به عرضه کیتهای استخراج پلاسمید از برندهای پیشروی جهانی نموده است. این کیتها با دارا بودن گواهینامه کنترل کیفیت، تضمین میکنند که ستونها دارای ظرفیت اتصال اعلام شده بوده و بافرها با دقت فرموله شدهاند. عملکرد یکنواخت بین batch های مختلف، قابلیت تکرارپذیری نتایج را برای پژوهشگران تضمین میکند. آزماکالا نه تنها تأمینکننده کالا، بلکه یک شریک علمی است. کارشناسان مجرب این شرکت قادر به ارائه مشاوره در انتخاب مناسبترین کیت با توجه به نوع باکتری، اندازه پلاسمید، حجم مورد نیاز و کاربرد نهایی هستند. با انتخاب کیتهای استخراج پلاسمید از آزماکالا، پژوهشگران و متخصصان زیستفناوری میتوانند با اطمینان از کیفیت مواد اولیه، گامهای بعدی طرحهای تحقیقاتی، تولیدی و تشخیصی خود را با دقت و سرعت بیشتری به پیش ببرند.
بدون دیدگاه